POCKIT
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POCKIT的檢測原理為何？POCKIT的檢測原理為聚合酶連鎖反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)，利用具有專一性的引子(primer)針對特定的核酸序列進行擴增反應(yīng)。目前PCR技術(shù)已經(jīng)廣泛的運用在人類疾病的檢測、親子鑒定、法醫(yī)鑒定、遺傳學研究等各種需要核酸偵測的領(lǐng)域。同時此一發(fā)明也獲頒1993年諾貝爾化學獎，大幅的增加疾病檢測的靈敏度，為近代分子生物學領(lǐng)域的最重大成就之一。 -
為何POCKIT的設(shè)備操作可以比較傳統(tǒng)的PCR簡單？反應(yīng)時間可以比較短？一般而言PCR在反應(yīng)過程需要三種不同的溫度，分別是利用高溫解離DNA雙股結(jié)構(gòu)(92 – 95℃, denaturing)，利用降低溫度使專一性引子黏合于特定序列(37 – 65℃, annealing)，以及再升溫至最適于熱穩(wěn)定性DNA聚合酶活性的溫度(72℃)進行延長反應(yīng)(extension)。因此相關(guān)的操作設(shè)備必須能夠快速的升溫與降溫，同時具備有高階的溫控系統(tǒng)。這使得設(shè)備變得相當復(fù)雜，重復(fù)的升降溫也造成設(shè)備容易損壞，和反應(yīng)時間的增加。
POCKIT則是利用熱對流的原理，此一物理現(xiàn)象即是描述當針對裝有液體的容器底部加熱時，由于上方表面較冷的液體比重較高，因此會因為重力向下移動；下方受熱的液體則因為比重較低，因此會被擠到向上移動，因此會自然形成液體的循環(huán)。當較熱的液體流動至表面時，又會因為環(huán)境的散熱而變冷，較冷的液體流動至底部時又會因為受熱而變熱，所以此一循環(huán)可以一直持續(xù)下去，進而形成穩(wěn)定的溫度梯度。此時如果藉由容器的設(shè)計，利用最適的管徑與高度，巧妙的控制對流的時間與散熱的速率，就可以形成適合PCR的反應(yīng)環(huán)境。當我們在特殊設(shè)計的容器中放入PCR反應(yīng)的試劑，并且控制底部的加熱溫度在92 -95℃之間，當試劑流至底部時，就可以進行解離DNA雙股結(jié)構(gòu)的反應(yīng)(denaturing)，當液體循環(huán)至容器頂端并且降溫時，就可以進行引子黏合(annealing)，之后再循環(huán)至較熱區(qū)域進行延長反應(yīng)(extension)。換言之，當熱對流不間斷的過程之中，PCR的反應(yīng)也隨之完成。
因此，POCKIT的優(yōu)勢就變的顯而易見。首先，因為只需單純的底部單一溫度控制，因此不需復(fù)雜的控溫系統(tǒng)與降溫系統(tǒng)，可以大幅的輕量化，并且更加耐用。第二，自然的溫度梯度取代機械式的升降溫，使得反應(yīng)更加穩(wěn)定，避免機械故障，同時省去升降溫所需的時間。POCKIT系統(tǒng)將熱對流的速率控制在每一圈15 – 20秒左右，遠比傳統(tǒng)的PCR有效率，因此可以大幅縮減反應(yīng)所需要的時間。 -
POCKIT的試劑與一般的PCR試劑有何不同？POCKIT的試劑與傳統(tǒng)的PCR非常相似，包含有引子、dNTP、反應(yīng)緩沖液、熱穩(wěn)定性DNA聚合酶、與核酸模板(template)等。因為POCKIT是利用熒光信號偵測PCR反應(yīng)產(chǎn)物，因此尚需如real-time PCR一般加入熒光探針(probe)，這也同時提高了反應(yīng)的專一性。
為了穩(wěn)定熱對流的流速，降低液體與管壁間的作用力，促進溫度梯度的形成，以及提升DNA聚合酶的效率，POCKIT的反應(yīng)緩沖液 – Uni-ii buffer中添加有若干的特定化學物。為了適用于更為寬廣的引子條件，我們提供了高鹽與低鹽兩種反應(yīng)緩沖液，以供使用者選擇。這也是POCKIT試劑與一般PCR最大的不同之處。 -
POCKIT的引子在設(shè)計上與一般的PCR試劑有何不同？與real-time PCR類似，并應(yīng)依照下列的基本規(guī)則設(shè)計：
● 產(chǎn)物大小應(yīng)小于150鹽基對(bps)，一般而言愈小愈好。
● Tm應(yīng)在58 – 62℃之間
● 避免4個以上的連續(xù)相同鹽基
● 3'末端的5個鹽基避免含3含以上的G與C
● G與C的比例應(yīng)該占全部的20 – 80%之間
● 總長度應(yīng)在15 – 25個鹽基之間
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POCKIT的熒光探針在設(shè)計上與一般的real-time PCR試劑有何不同？最適用于POCKIT的熒光探針為TaqMan probe，其基本的設(shè)計規(guī)則如下：
● 5'端熒光團應(yīng)使用FAM (520 nm)或 JOE、VIC (550nm)
● 3'端熒光抑制染劑(quencher dye)應(yīng)用black hole quencher (BHQ1)或是minor groove binder (MGB)
● Tm應(yīng)在68 – 72℃之間 – 高于引子10℃
● 與引子間應(yīng)至少有一個mer 的距離以避免立體干擾
● 避免4個以上的連續(xù)相同鹽基
以下為與一般real-time PCR不同之處
● G與C的比例應(yīng)該占全部的40 – 80%之間
● 總長度應(yīng)在15 – 30個鹽基之間，短比長好
● 5'端與模板間的黏合強度要強(較大的負自由能，ΔG)
● 應(yīng)避免設(shè)計在模板二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定區(qū)域
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是否一定要使用POCKIT專用的毛細管進行反應(yīng)？是的。因為以下的原因：
● 光學塑料材質(zhì)：熒光透光性強
● 醫(yī)療塑料等級：無DNase/RNase污染
● 專利底部金屬環(huán)設(shè)計：加熱均勻
● 完美管徑與管高比例：提供熱隔絕恒溫PCR的最佳環(huán)境
● 內(nèi)徑平整：穩(wěn)定熱對流循環(huán)
● 緊配內(nèi)蓋：避免試劑揮發(fā)污染
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是否有已經(jīng)商品化的試劑可以直接使用，而不需自行設(shè)計？有的，可以運用于POCKIT系統(tǒng)并且已經(jīng)商品化的試劑如下：
● IQ plus系列：為針對水產(chǎn)養(yǎng)殖市場所開發(fā)的試劑組劑組
● PetNAD系列：為針對寵物市場所開發(fā)的試劑組
● POCKIT kits for food animal系列：為針對家畜禽養(yǎng)殖市場所開發(fā)的試劑組
詳細的內(nèi)容請參考公司網(wǎng)站或是各品牌的網(wǎng)站 -
已經(jīng)商品化的POCKIT試劑是否也可以用在傳統(tǒng)的PCR或是real-time PCR之上？可以，但是因為以下的原因并不建議
● 反應(yīng)條件未于傳統(tǒng)PCR或是real-time PCR上最優(yōu)化
● 引子與酵素的濃度高于傳統(tǒng)PCR或是real-time PCR所需，較易產(chǎn)生非專一性反應(yīng)
● 不含被動性熒光染劑(passive dye, 如ROX)
● 緩沖液系統(tǒng)與傳統(tǒng)PCR或是real-time PCR不同
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POCKIT可以偵測RNA嗎？可以執(zhí)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(reverse transcription)嗎？可以，POCKIT內(nèi)建程序中最開始就是執(zhí)行50℃10分鐘的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。不論是DNA或是RNA的模板，系統(tǒng)都會一律的執(zhí)行此一步驟。POCKIT系統(tǒng)所提供的Uni-ii緩沖液同時適用于反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以及PCR反應(yīng)，使用者只需確認于反應(yīng)中有添加反轉(zhuǎn)錄酵素(MMLV or AMV reverse transcriptase)即可。添加量與傳統(tǒng)的PCR相同。 -
POCKIT在檢測運用上有那些限制？POCKIT是針對于核酸，也就是DNA以及RNA進行檢測，因此對于感染性疾病的病源，如病毒、細菌、寄生蟲等的核酸，或是某些因為特定DNA變異造成的遺傳性疾病，都可以有效的檢測。但是對于一些代謝的指標，如肝指數(shù)、血糖等，或是不具核酸的病源如狂牛癥，以及像是毒品與禁藥、農(nóng)業(yè)等化學物質(zhì)，則無法進行檢測。 -
POCKIT是新的技術(shù)嗎？它的質(zhì)量穩(wěn)定嗎？POCKIT是全新的技術(shù)，但是基于以下的原因，它也是非常穩(wěn)定的技術(shù)
● POCKIT的基本原理是PCR，是分子生物領(lǐng)域最廣為應(yīng)用，最穩(wěn)定的技術(shù)
● POCKIT的加熱原理與反應(yīng)采用自然界的現(xiàn)象 - 熱對流，比機械式的控制更為簡單、有效
● POCKIT的研發(fā)、生產(chǎn)、與銷售流程皆符合醫(yī)療器材質(zhì)量管理系統(tǒng)ISO13485:2003以及體外檢測(in-vitro diagnosis, IVD)
GMP的生產(chǎn)規(guī)范。
● POCKIT的生產(chǎn)制造商 - 瑞基公司，是臺灣分子檢測市場的標竿企業(yè)。其2011年所獲獎項如下：
? 小巨人獎
? 臺北生技獎金牌獎
? 行政院農(nóng)委會菁創(chuàng)獎
? 中部科學園區(qū)創(chuàng)新產(chǎn)品獎
? 亞洲科學園區(qū)協(xié)會優(yōu)良生技廠商獎
● 運用POCKIT技術(shù)于不同領(lǐng)域的學術(shù)研究已經(jīng)陸續(xù)發(fā)表在全球知名期刊之上，證明這是一種有效且可以廣泛運用的技術(shù)。
● 運用POCKIT技術(shù)所開發(fā)的試劑 - IQ plus WSSV Detection System已通過 -
POCKIT是可攜帶式的設(shè)計嗎？在操作環(huán)境上有沒有限制？POCKIT在設(shè)計之初就是鎖定現(xiàn)場攜帶式的核酸檢測設(shè)備，因此當有這種需求時，可以選擇投資POCKIT Xpress – 行動實驗室。它包含了POCKIT核酸分析儀一臺，cubee小型高速離心機一臺，以及高精度移液器二支，上述設(shè)備都包裝于儀器專用防水硬殼行李箱之中。行李箱內(nèi)還具有專門的空間可以放置塑料類的耗材，與反應(yīng)所需的試劑，足以應(yīng)付現(xiàn)場從采集樣本、核酸萃取、一直到最終PCR結(jié)果分析的所有需求。
POCKIT在操作環(huán)境上仍然是有基本的限制存在，包括：
● 必須有穩(wěn)定的交流電源供應(yīng)，100 – 240V，50/60Hz
● 擺放儀器的平面必須相對平整
● 環(huán)境溫度的范圍為15 - 35℃
以上二、三點皆與熱對流的穩(wěn)定性有關(guān)。 -
POCKIT可以于單一反應(yīng)檢測多重標的嗎？可以，POCKIT的光學系統(tǒng)可以利用窄波長濾鏡(band pass filter)，收取520nm及550nm兩種不同的散射光源信號，因此只要將不同標的的熒光探針分別標定合適的熒光物，如FAM (520nm)以及JOE (550nm)，即可于單一反應(yīng)之中同時檢測兩種標的。
POCKIT系統(tǒng)的PCR反應(yīng)是利用熱對流所產(chǎn)生的溫度梯度所驅(qū)動，與傳統(tǒng)的PCR不同，因此在設(shè)計雙重標的(duplex system)的實驗時，必須要特別注意引子、探針之間產(chǎn)生雙重子(dimer)，以及引子、探針本身產(chǎn)生二級結(jié)構(gòu)的可能，以避免反應(yīng)之間互相干擾。
雙重標的系統(tǒng)之間多少都會彼此競爭反應(yīng)資源，此一部份的設(shè)計理念與傳統(tǒng)的雙重標的PCR系統(tǒng)相同。
因為熒光物質(zhì)的特性，520nm的散射光信號可能會影響到550nm，因此一般建議請將主要的檢測標的設(shè)計于520nm，并將次要的標的如內(nèi)控制組(internal control)設(shè)計于550nm。 -
使用者可以自行設(shè)定反應(yīng)條件嗎？使用者唯一可以設(shè)定的反應(yīng)條件是波長的選擇，分別是520nm單波長、550nm單波長、以及520 + 550nm雙波長三種選擇。 在反轉(zhuǎn)錄以及熱隔絕恒溫PCR部分，經(jīng)過多年的研究與測試，最廣泛性且優(yōu)化的反應(yīng)條件組合已經(jīng)被找到，并且已經(jīng)成功的運用在POCKIT系統(tǒng)之上。為了輕量化、使用接口簡單化和人性化、和可移植性設(shè)計，POCKIT將所有非必要的功能都盡量舍棄，因此使用者無法自行設(shè)定相關(guān)的反應(yīng)條件。然而，單一反應(yīng)條件、人性化使用接口、與極簡的設(shè)計理念，正是POCKIT與眾不同之處。 -
使用者于反應(yīng)結(jié)束后需要自行判讀結(jié)果嗎？POCKIT內(nèi)建Android智能型手機芯片系統(tǒng)，會于反應(yīng)前后搜集、運算、監(jiān)控內(nèi)部光學系統(tǒng)的運作，并于反應(yīng)結(jié)束后直接將熒光信號的變化比轉(zhuǎn)化為結(jié)果，并且顯示于觸控屏幕上。因此使用者無需自行判讀結(jié)果，所有的工作POCKIT都會代為執(zhí)行。同時反應(yīng)前后光學系統(tǒng)的定位照片、熒光原始讀值、熒光比、與判讀結(jié)果，都會存檔于SD卡中以開機時間為目錄名的目錄之下，可供用戶隨時做為查詢、記錄、確認之使用。 -
POCKIT是定量的系統(tǒng)嗎？可以像real-time PCR一樣定量嗎？POCKIT的光學系統(tǒng)設(shè)計與試劑設(shè)計原理都與real-time PCR非常相似，有潛力可以發(fā)展成定量的系統(tǒng)，但是為了考慮具有定量需求的現(xiàn)場檢測項目有限，同時為了貫徹輕量化、使用接口簡單化和人性化、和可移植性設(shè)計，POCKIT舍棄了定量功能，而只具備了判讀正負的定性能力。 當科技持續(xù)進步，使得芯片運算與控制能力進一步提升時，下一代的POCKIT將會很有機會可以像real-time PCR一樣，具有核酸定量能力，同時保有可攜式的特性。 -
請問要如何優(yōu)化自行設(shè)計的POCKIT引子對？判定的標準為何？PCR反應(yīng)的成敗有相當程度的依賴引子的質(zhì)量，其可能的影響因子如下：
● 引子的設(shè)計：Tm、二級結(jié)構(gòu)、雙重子(dimer)的形成可能等
● 引子的合成質(zhì)量：供貨商的經(jīng)驗、合成原物料的質(zhì)量、純化的方法等
● 引子的濃度
使用者基本上可以依照Q4所述的原則進行設(shè)計，并建議如下：
● 左右兩端的引子除了原本的設(shè)計之外，都可以試著以多一兩個鹽基或是少一兩個鹽基的方式多合成幾條，并藉由不同的
排列組合中，找到最佳的引子對
● 合成時要求引子必須以PAGE純化
● 合成時要求引子必須以PAGE純化
● 測試不同的引子對比例，以及濃度，以及使用的酵素濃度，找尋最佳條件。
● 在靈敏度上，可藉由陽性樣品的序列稀釋，測試不同條件的稀釋終點，以最靈敏的條件為最佳
● 在靈敏度上，可藉由陽性樣品的序列稀釋，測試不同條件的稀釋終點，以最靈敏的條件為最佳
● 一般而言，POCKIT系統(tǒng)的靈敏度至少可達100 copies/反應(yīng) -
我沒有接觸過熒光探針，請問我可以從哪里獲得設(shè)計熒光探針的知識？可以上網(wǎng)找尋有關(guān)TaqMan probe的相關(guān)信息，或是與瑞基公司的技術(shù)團隊聯(lián)絡(luò)。其基本的設(shè)計原理已于Q5的回答中詳述。 -
瑞基公司有提供熒光探針的合成與測試服務(wù)嗎？ 并沒有，但是我們提供POCKIT系統(tǒng)熒光探針的設(shè)計咨詢服務(wù)，以及改善方向的建議。 -
請問市售的PCR緩沖液與酵素可以直接用在POCKIT這套系統(tǒng)上嗎？可以，但是并不建議。如Q3的回答中所描述，為了穩(wěn)定熱對流的流速，降低液體與管壁間的作用力，促進溫度梯度的形成，以及提升DNA聚合酶的效率，POCKIT的反應(yīng)緩沖液 – Uni-ii buffer中添加有若干的特定化學物，而這些物質(zhì)是市售PCR緩沖液中所沒有的。因此，仍然建議使用POCKIT的專屬緩沖液。POCKIT專用的Uni-ii buffer中已含有最佳濃度的dNTP，因此使用者不需另行添加。
至于酵素部份，因為市售的品牌與種類繁多，使用者必須自行測試與比較，如果不想浪費時間在測試酵素上，也可以直接選購POCKIT專用的酵素。酵素的使用量會依不同的反應(yīng)系統(tǒng)而不同，于條件優(yōu)化之前，可先依傳統(tǒng)PCR及RT-PCR的建議使用量添加，之后再依優(yōu)化的結(jié)果酌予增減。